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CRISPR工具可使RNA编辑可靶向的致病突变数增加一倍

基于CRISPR的基因编辑工具彻底改变了科学家如何靶向基因突变和操纵基因表达的方式。这种工具取决于使用Cas9和Cas12酶靶向DNA,以及Cas13靶向RNA。

修饰RNA可能具有一些优势,因为它避免了对基因组的永久修饰,并使CRISPR技术更适用于某些细胞类型,例如神经元,事实证明使用基于CRISPR-Cas9的方法难以编辑。由McGovern Institute研究员,麻省理工学院和哈佛大学广泛研究所的核心成员Zhang Feng博士领导的研究人员,目前正在报告一种新方法,该方法将失活的Cas13与新颖的可编程酶结合,靶向并随后将特定的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶(从C到U的转化)的靶向RNA转录本。

该技术的首字母缩写为RESCUE(从特定C到U交换的RNA编辑),基于该团队现有的REPAIR(从可编程A到I(G)替代的RNA编辑)技术,该技术将Cas13靶向的腺嘌呤残基转化为肌苷。《科学》杂志报道说,研究人员描述了最初的实验,通过该实验,RESCUE可瞬时和可逆地增加β-catenin的激活和细胞生长,并将APOE4变异体转化为APOE2。他们认为,这项新技术极大地扩展了基于CRISPR的工具的范围,使首次修饰蛋白质上的关键位置(例如磷酸化位点)成为可能。蛋白质磷酸化位点可充当蛋白质活性的开/关开关,并存在于信号分子和癌症相关途径中。

“为了治疗引起疾病的遗传变异的多样性,我们需要一系列精确的技术供您选择,”张说。“通过开发这种新酶并将其与CRISPR的可编程性和精度相结合,我们能够填补工具箱中的关键空白。” Zhang是MIT的James and Patricia Poitras神经科学教授。张还曾在麻省理工学院的脑与认知科学和生物工程系任职。研究人员发表的描述RESCUE技术的论文标题为“ 用于可编程单碱基RNA编辑的胞嘧啶脱氨酶 ”。

Zhang先前开发的REPAIR技术使用Cas13来指导RNA编辑酶的催化结构域(作用于RNA 2(ADAR2)的腺苷脱氨酶)到达RNA的靶位,并在其中以单碱基精度将腺苷转化为肌苷。但是,作者指出,REPAIR和其他RNA编辑技术仅允许A到I转换。“将胞嘧啶核苷转化为尿苷的精确RNA编辑技术将大大扩大可解决的疾病突变和蛋白质修饰的范围。”

可以催化C到U转换的天然酶已用于DNA碱基编辑,但它们仅对单链核酸起作用,并且可能显示脱靶编辑。为了解决这些问题,研究小组通过将天然作用于双链RNA底物的ADAR2的腺嘌呤脱氨酶结构域发展为胞苷脱氨酶,建立了自己的系统。然后将生成的演化的ADAR2融合到停用的Cas13(dCas13),然后进一步演化为RESCUE工具。

该团队在培养的人类细胞中测试了该新平台,证明它们可以精确地靶向细胞中的天然RNA,还可以靶向合成RNA中的24种临床相关突变。然后,他们进一步优化了RESCUE,以减少脱靶编辑,但又不会显着干扰脱靶编辑。

与永久的DNA水平编辑相反,RNA编辑的主要优点是它是可逆的,因此RESCUE可用于在RNA中进行瞬时的,暂时的修饰。Zhang的团队通过使用RESCUE靶向已知编码在蛋白质产物上磷酸化的β-catenin的RNA中的特定位点,在人细胞中证明了这一点。所述修饰导致β-连环蛋白活化和细胞生长的暂时增加。“我们测试了一组针对已知磷酸化残基的针对β-catenin转录本(CTNNB1)的指南,并观察到5%至28%的编辑水平,从而导致Wnt /β-catenin信号激活多达5倍,并增加了细胞生长……”团队写道。如果这种变化是永久性的,则可能导致细胞生长失控和癌症,

研究人员还使用RESCUE靶向ApoE4,它是ApoE蛋白的一种变异体,被广泛认为是晚期阿尔茨海默氏病的遗传危险因素。ApoE4同工型与非致病性ApoE2的区别在于序列上有两个单碱基变化,两个碱基均为ApoE4中的C和ApoE2中的U。Zhang及其同事将与风险相关的ApoE4 RNA引入细胞,并展示了RESCUE如何将ApoE4特异性胞嘧啶核苷转换回尿苷,有效地恢复ApoE2序列,从而将风险变异体转化为非风险变异体。

C到U转换的能力为研究人员提供了使用RESCUE靶向通过翻译后修饰(例如磷酸化,糖基化或甲基化)调节蛋白质活性的位点的机会。这组作者说:“ RESSUE使通过RNA编辑可靶向的致病突变数量翻了一番,并能调节与磷酸信号相关的残基。” “ RESCUE具有更大的可靶向氨基酸密码子空间,可以调节更多的翻译后修饰,例如磷酸化,糖基化和甲基化,以及扩大靶向的常见催化残基,疾病突变和保护性等位基因,例如ApoE2。”

Zhang实验室的目的是与科学界共享RESCUE系统,以鼓励进行更多研究以使RESCUE靠近临床,并为研究人员提供一种新工具,以更好地了解引起疾病的突变。该技术将通过非营利性质粒储存库Addgene免费提供给学术研究。

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